茶樹嘌呤生物堿主要包括咖啡堿、可可堿和苦茶堿等。苦茶堿（1,3,7,9-四甲基尿酸）是一種天然產(chǎn)物，具有顯著的抗抑郁、鎮(zhèn)靜、催眠等藥理活性，而咖啡堿（1,3,7-三甲基黃嘌呤）既是重要茶葉品質(zhì)成分，又有一些特殊人群對它非常敏感。因此，培育高苦茶堿和/或低咖啡堿的茶樹品種將增加茶的健康益處并促進(jìn)消費(fèi)。然而，茶樹咖啡堿與苦茶堿的合成及調(diào)控機(jī)制尚未充分闡明，相關(guān)的優(yōu)異基因未能得到充分發(fā)掘利用。

近期，JCR 園藝學(xué)Top1期刊Horticulture Research在線發(fā)表了我所茶樹種質(zhì)資源創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)題為“A novel TcS allele conferring the high-theacrine and low-caffeine traits and having potential use in tea plant breeding”（論文1）和“Deeply functional identification of TCS1 alleles provides efficient technical paths for low-caffeine breeding of tea plants”（論文2）的研究論文。

研究人員先通過無苦茶堿‘中茶302’(ZC302)和富含苦茶堿特異資源‘乳源苦茶’(RY)人工雜交構(gòu)建了超過180個個體的F1群體，后又以其中的高苦茶堿F1單株為父本構(gòu)建了多個人工雜交群體。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)1個體的苦茶堿含量與咖啡堿含量呈高度負(fù)相關(guān)（R2 >0.9），高苦茶堿個體與無苦茶堿個體呈1：1分離。混合分組轉(zhuǎn)錄組測序、分子標(biāo)記定位和基因表達(dá)分析表明苦茶堿合成酶(TcS)基因是決定高苦茶堿性狀的關(guān)鍵候選基因，并通過穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化煙草進(jìn)一步明確了TcS的功能。在30份具有廣泛遺傳背景的茶樹資源中，僅8份資源含有TcS基因。體外酶活性測定表明‘RY’中TcS編碼的蛋白酶活性較高，并進(jìn)一步利用突變實(shí)驗(yàn)證明了第241個氨基酸是TcS的關(guān)鍵殘基。與其他資源相比，‘RY’的TcS啟動子存在著234 bp的缺失和271 bp的插入，GUS組織化學(xué)分析和雙熒光素酶活測定結(jié)果均表明‘乳源苦茶’中的TcS啟動子活性相對較高?；?ldquo;TcS啟動子271 bp的插入”開發(fā)了一個功能標(biāo)記，它與‘RY’的F1群體和F2群體中的高苦茶堿個體均共分離。上述研究結(jié)果表明，新的TcS等位基因?qū)е?lsquo;RY’及其子代形成了高苦茶堿、低咖啡堿性狀。

圖1 高苦茶堿功能標(biāo)記的開發(fā)與驗(yàn)證

茶樹咖啡堿合酶(TCS1)是咖啡堿生物合成途徑中最關(guān)鍵的N-甲基轉(zhuǎn)移酶（NMT），它催化N-3和N-1的甲基化。參與咖啡堿與可可堿等嘌呤生物堿生物合成的NMTs存在著獨(dú)立進(jìn)化機(jī)制，這使得TCS1有著多樣的序列變異。除了先前發(fā)現(xiàn)的8種TCS1等位變異外，論文2在673份茶樹種質(zhì)資源中鑒定出了新的等位基因TCS1h。體外活性分析結(jié)果表明，TCS1h同時具有可可堿合酶(TS)和咖啡堿合酶(CS)活性，通過點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)明確除第225位氨基酸殘基外，其第269位氨基酸殘基也決定CS的活性高低。研究發(fā)現(xiàn)咖啡堿、苦茶堿等的含量與相應(yīng)功能基因和等位基因的表達(dá)有關(guān)，基因表達(dá)的有無和水平的高低在很大程度上決定了茶樹中嘌呤生物堿的含量。通過GUS組織化學(xué)分析和雙熒光素酶檢測表明TCS1e和TCS1f的啟動子活性明顯較低，并進(jìn)一步通過缺失突變及點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)確定了一個關(guān)鍵的順式作用元件(G-box)。綜合本研究及前期的研究結(jié)果，將已發(fā)現(xiàn)的9種TCS1等位基因分為三種功能不同的類型（只有TS活性、有TS和CS活性但轉(zhuǎn)錄水平較低、有TS和CS活性且轉(zhuǎn)錄水平較高），并在多年的種質(zhì)創(chuàng)新實(shí)踐基礎(chǔ)上提出了低咖啡堿育種的技術(shù)路徑(圖2)。

圖2 三種低咖啡堿茶樹育種技術(shù)路徑

上述研究結(jié)果將有助于深入了解低咖啡性狀和高苦茶堿性狀形成的遺傳基礎(chǔ)，開發(fā)的功能標(biāo)記將加快品種培育的速度，為選育高苦茶堿和/或低咖啡堿茶樹品種提供了理論與技術(shù)支撐和優(yōu)異基因資源。