doi.org/10.1016/j.jaci.2022.09.037

鼻腔是第一道防線

在人鼻黏膜上皮原代細(xì)胞（原代HNEpC）中開展體外實驗，采用TLR3典型激動劑Poly（I：C）刺激細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)poly（I：C）能夠刺激鼻上皮EV分泌，分泌量隨著時間延長、劑量增加而增加，且不存在細(xì)胞毒性。

確認(rèn)刺激有效后，隨之采用TLR3/dsRNA復(fù)合物抑制劑或（和）IRF3激動劑KIN1148驗證了這種效應(yīng)是通過激活TLR3-IRF3信號軸介導(dǎo)的。之后，研究者將TLR3刺激的EV與未刺激的對照EV進(jìn)行比較，證實二者特征沒有顯著差異。最后，研究者探討了TLR3刺激EV在原代HNEpC中的上皮間轉(zhuǎn)運(yùn)動力學(xué)，發(fā)現(xiàn)37℃時，細(xì)胞攝取迅速，且在60分鐘內(nèi)逐漸擴(kuò)散到整個細(xì)胞質(zhì)中。然而在氯丙嗪預(yù)處理、4℃低溫環(huán)境下，細(xì)胞攝取顯著抑制了87.5%，擴(kuò)散速度顯著減慢。表明低溫對于細(xì)胞攝取EV存在明顯抑制作用。

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TLR3刺激的EV表現(xiàn)出有效的抗呼吸道病毒活性

明確TLR3刺激顯著增加鼻上皮EV分泌后，接下來分析這些EV是否具有內(nèi)在的抗病毒活性。研究者采用冠狀病毒CoV_OC43、次要群鼻病毒RV-1B和主要群鼻病毒RV-16分別在原代HNEpC中構(gòu)建上呼吸道病原體模型，發(fā)現(xiàn)原代HNEpC普遍出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)的空泡化、變圓和脫落，并通過病毒dsRNA檢測表明已成功誘導(dǎo)細(xì)胞病變效應(yīng)和宿主細(xì)胞免疫應(yīng)答，證實模型成功。

之后評估TLR3刺激的EV介導(dǎo)的體外抗病毒活性，發(fā)現(xiàn)TLR3刺激可能會改變EV中的因子物質(zhì)并賦予EV增強(qiáng)的抗病毒特性。

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TLR3刺激上調(diào)EV中的miR-17增強(qiáng)抗病毒活性

明確TLR3刺激的EV有抗病毒活性后，研究者進(jìn)一步探索了潛在的抗病毒機(jī)制，通過層次聚類分析、火山圖數(shù)據(jù)分析，最終發(fā)現(xiàn)6個在TLR3刺激后顯著上調(diào)并與抗病毒作用相關(guān)的miRNA，其中將已被報道在上呼吸感染期間抑制病毒復(fù)制的miR-17作為待驗證的作用機(jī)制目標(biāo)。

采用qPCR證實與未受刺激對照細(xì)胞相比，TLR3刺激顯著增加了EV中miR-17的表達(dá)；在未受刺激對照細(xì)胞中，miR-17過表達(dá)或沉默發(fā)現(xiàn)miR-17抑制了病毒RNA復(fù)制，顯著降低了宿主細(xì)胞中CoV_OC43、RV-1B和RV-16病毒mRNA水平，證實了miR-17對呼吸道病毒的強(qiáng)大抗病毒活性。在TLR3刺激的細(xì)胞中，同樣進(jìn)行miR-17過表達(dá)或沉默，發(fā)現(xiàn)與未受刺激對照細(xì)胞相比，TLR3刺激誘導(dǎo)的EV中miR-17抗病毒活性更強(qiáng)，證實TLR3刺激上調(diào)EV中的miR-17增強(qiáng)抗病毒活性。

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TLR3刺激的EV表面受體-病毒結(jié)合

有助于抗病毒活性并防止病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞

研究者發(fā)現(xiàn)TLR3刺激的EV表面受體蛋白質(zhì)可以與病毒相結(jié)合，阻止病毒進(jìn)入細(xì)胞，與細(xì)胞受體結(jié)合，而未受刺激的對照EV對阻斷病毒感染沒有顯著影響。

研究者分析了TLR3刺激的EV中LDLR，ICAM-1和N-乙酰神經(jīng)氨酸（NANA）的水平，它們分別參與受體介導(dǎo)的RV-1B，RV-16和CoV_OC43的內(nèi)吞作用，發(fā)現(xiàn)TLR3刺激上調(diào)EV中的LDLR和ICAM-1水平，另外因技術(shù)限制，NANA無法檢測。

為了探索LDLR和ICAM-1在EV中抑制病毒感染的作用，在TLR3刺激的EV中沉默LDLR或ICAM-1 mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)LDLR或ICAM-1沉默回削弱對應(yīng)的病毒與TLR3刺激的EV之間的相互作用，從而促進(jìn)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞。

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冷暴露會損害TLR3依賴性EV分泌

和miR-17豐度

從而消除抗病毒活性

研究者分析了降溫對TLR3依賴性EV功能的影響。通過人體鼻內(nèi)溫度梯度試驗發(fā)現(xiàn)當(dāng)環(huán)境溫度從23.3℃降低到4.4℃后，前鼻甲和中下鼻甲水平的鼻內(nèi)溫度分別下降了6.4℃和4.7℃?；谏鲜鰧嶒灲Y(jié)果，在體外培養(yǎng)實驗時采用降低5℃的方法，發(fā)現(xiàn)在37℃時，TLR3依賴性EV分泌顯著增加，而32℃時，則顯著損害了TLR3依賴性EV分泌。

接下來研究冷暴露對TLR3刺激的EV介導(dǎo)的抗病毒活性的影響，發(fā)現(xiàn)冷暴露下TLR3依賴性EV抗病毒活性降低，miR-17的豐度降低，表明冷暴露可能通過這種機(jī)制來消除抗病毒活性。

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冷暴露降低TLR3依賴性EV表面受體蛋白表達(dá)，損害由表面受體-病毒相互作用介導(dǎo)的抗病毒活性

在37℃時，與未刺激對照細(xì)胞相比，TLR3刺激EV中LDLR、ICAM-1表達(dá)顯著增加，而當(dāng)溫度降到32℃時，TLR3刺激EV中LDLR、ICAM-1顯著受損，表明TLR3刺激EV中表面受體蛋白LDLR和ICAM-1表達(dá)增加受環(huán)境溫度影響。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)冷暴露會顯著損害由表面受體-病毒相互作用介導(dǎo)的抗病毒活性，但是對于TLR3刺激的EV抗病毒活性沒有顯著影響。

doi.org/10.1016/j.jaci.2022.09.037

小結(jié)

上呼吸道感染存在季節(jié)性變化，尤其在冬季，感染率增加，這是因為冷暴露會損害由鼻上皮EV介導(dǎo)的抗病毒免疫防御功能，且這可能是通過下調(diào)TLR3依賴性EV分泌和miR-17豐度，降低TLR3依賴性EV表面受體蛋白表達(dá)等來實現(xiàn)的。

想一想，新冠的到來使得我們離不開口罩，而口罩的存在可以給予鼻腔一定的溫暖，間接保護(hù)了鼻內(nèi)免疫防御機(jī)制，降低了呼吸道病毒的感染幾率，也不失為又一個戴口罩的理由。

參考文獻(xiàn)：

[1] Di Huang, Maie S. Taha, Angela L. Nocera, Alan D. Workman, Mansoor M. Amiji, Benjamin S. Bleier,Cold exposure impairs extracellular vesicle swarm–mediated nasal antiviral immunity,

Journal of Allergy and Clinical Immunology,2022. doi.org/10.1016/j.jaci.2022.09.03