肺癌是對(duì)人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。近年來(lái)，肺癌的發(fā)病率在多數(shù)國(guó)家呈現(xiàn)明顯增高的跡象，其中，非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）占比約85%。目前，基因測(cè)序技術(shù)已在NSCLC診斷、靶向治療、預(yù)后研究中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

在過(guò)去的20年里，雖然全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）已經(jīng)將40余個(gè)遺傳位點(diǎn)與NSCLC聯(lián)系起來(lái)，但前期大多數(shù)研究都是基于歐洲人群進(jìn)行的，目前仍缺乏對(duì)于中國(guó)人群的大規(guī)模研究，并且基于基因陣列插補(bǔ)的傳統(tǒng)GWAS仍然存在一定的局限性。首先，基因陣列只覆蓋了部分基因組變異，對(duì)于基因組中其他基因變異的推斷依賴于插補(bǔ)技術(shù)，因此其準(zhǔn)確性依賴人群匹配且更全面的單倍型參考基因面板（panel）。其次，基因陣列插補(bǔ)只適用于常見(jiàn)的低頻變異，無(wú)法準(zhǔn)確分析罕見(jiàn)致病變異。

為解決上述難題，近日，南京醫(yī)科大學(xué)沈洪兵/胡志斌團(tuán)隊(duì)對(duì)來(lái)自南京肺癌隊(duì)列（NJLCC）的2984例NSCLC病例和3020例無(wú)癌對(duì)照進(jìn)行了大規(guī)模全基因組測(cè)序（WGS），鑒定了20余個(gè)NSCLC相關(guān)的常見(jiàn)致病性突變，其中5個(gè)為新發(fā)現(xiàn)致病變異，并發(fā)現(xiàn)DNA修復(fù)基因中的罕見(jiàn)功能缺失變異以及BRCA2啟動(dòng)子中的罕見(jiàn)變異增加了非小細(xì)胞肺癌風(fēng)險(xiǎn)。相關(guān)研究成果已發(fā)表在Cancer Cell上，文章題為“Analyses of rare predisposing variants of lung cancer in 6,004 whole genomes in Chinese”。

將WGS技術(shù)應(yīng)用于中國(guó)人群肺癌致病變異的鑒定不僅可以構(gòu)建中國(guó)人群的特異性單倍型基因參考數(shù)據(jù)庫(kù)，提高常見(jiàn)和低頻變異插補(bǔ)的準(zhǔn)確性和覆蓋度，增加發(fā)現(xiàn)新易感變異的可能性，還可以為系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)肺癌罕見(jiàn)致病變異提供信息。

文章發(fā)表在Cancer Cell

主要研究?jī)?nèi)容

NSCLC和無(wú)癌對(duì)照個(gè)體的種系變異概述

首先，研究人員對(duì)從NJLCC招募的3043名NSCLC患者和3084名無(wú)癌對(duì)照者進(jìn)行了WGS。通過(guò)嚴(yán)格的數(shù)據(jù)質(zhì)控，最終共有2984例NSCLC患者和3020例對(duì)照個(gè)體被納入后續(xù)分析流程，并確定了100565590個(gè)短小變異，包括91942266個(gè)單核苷酸變異（SNV）和8623324個(gè)小片段插入或缺失（INDEL）。其中，8.79%的SNV和12.56% 的INDEL被認(rèn)為是常見(jiàn)、低頻變異，其它絕大多數(shù)為罕見(jiàn)變異，并且68.59%的罕見(jiàn)變異未收錄在gnomAD數(shù)據(jù)庫(kù)中。

圖1. 整體研究流程示意圖，來(lái)源：Cancer Cell

鑒定出5個(gè)新的NSCLC常見(jiàn)和低頻易感位點(diǎn)

研究人員按組織學(xué)類型（肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌）、性別（男性和女性）或吸煙狀況（吸煙者和終生不吸煙者）對(duì)整體NSCLC和亞組進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，共發(fā)現(xiàn)20個(gè)位點(diǎn)可以達(dá)到全基因組顯著性水平。在這20個(gè)位點(diǎn)中，有5個(gè)位點(diǎn)未被報(bào)道過(guò)，其中2個(gè)基因位點(diǎn)與整體NSCLC的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。同時(shí)，這5個(gè)變異位點(diǎn)與NSCLC風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)也在另外的獨(dú)立隊(duì)列中得到了驗(yàn)證，該隊(duì)列包括2018例患者和2392例非癌癥對(duì)照。

圖2. 全基因組關(guān)聯(lián)分析鑒定五個(gè)顯著性易感位點(diǎn)，來(lái)源：Cancer Cell

為了確定5個(gè)未被報(bào)道的NSCLC相關(guān)位點(diǎn)的功能相關(guān)基因，研究團(tuán)隊(duì)利用NSCLC中國(guó)患者的116個(gè)相鄰正常肺組織的基因型和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，構(gòu)建了肺組織特異性表達(dá)定量性狀位點(diǎn)（eQTL）數(shù)據(jù)庫(kù)。對(duì)于先前未報(bào)道的2個(gè)具有共同變異的位點(diǎn)和先前報(bào)道的五個(gè)獨(dú)立共同變異的位點(diǎn)，通過(guò)整合NJLCC eQTL數(shù)據(jù)集和GWAS數(shù)據(jù)集，進(jìn)行了位點(diǎn)級(jí)GWAS-eQTL共定位分析。最終確定這些變異位點(diǎn)與SRC、DSP、RGL2、BTN3A2和CCDC116相關(guān)聯(lián)。

圖3. NSCLC高危位點(diǎn)的潛在易感基因的鑒定，來(lái)源：Cancer Cell

BRCA2、癌癥易感基因和DNA損傷修復(fù)途徑基因中罕見(jiàn)致病性LOF負(fù)荷增加

在對(duì)編碼序列中罕見(jiàn)變異（MAF<0.5%）的深入分析中，研究團(tuán)隊(duì)共納入了3268個(gè)至少有3個(gè)LOF變異的基因。結(jié)果顯示，BRCA2具有最高的信號(hào)，在經(jīng)過(guò)多次校正后，其風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性仍然顯著。在NSCLC個(gè)體中，研究人員在BRCA2的標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)錄本中鑒定出22個(gè)LOFs變體，其中14個(gè)P/LP變體在ClinVar數(shù)據(jù)庫(kù)中有記錄，其他8個(gè)沒(méi)有記錄。更加有意思的是，在NSCLC個(gè)體中發(fā)現(xiàn)的BRCA2的LOFs變體主要位于RAD51的結(jié)合位點(diǎn)。

除BRCA2外，肺癌患者中其他10個(gè)CpG的LoF變異負(fù)荷也高于非癌癥對(duì)照組，包括RAD50、ATM、FANCA、ERCC6、RAD51D、FANCM、WRN、CHEK2、NBN及MRE11A。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，LoF負(fù)荷增加的15個(gè)CpG參與了DNA損傷修復(fù)（DDR）過(guò)程。

圖4. 罕見(jiàn)LOF變異與NSCLC風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性分析，來(lái)源：Cancer Cell

調(diào)控區(qū)域的罕見(jiàn)功能變異與NSCLC的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)

在基于啟動(dòng)子的關(guān)聯(lián)分析中，研究團(tuán)隊(duì)共納入了10041個(gè)至少有3個(gè)功能變異的基因，發(fā)現(xiàn)BRCA2啟動(dòng)子區(qū)與肺癌風(fēng)險(xiǎn)存在顯著相關(guān)性。BRCA2啟動(dòng)子與NSCLC風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系在包含2018例患者和2392例對(duì)照的獨(dú)立隊(duì)列中也得到了驗(yàn)證。此外，研究人員在一個(gè)獨(dú)立的前瞻性隊(duì)列中對(duì)BRCA2啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行了Sanger測(cè)序，該隊(duì)列有23826名參與者（包括301名新診斷為NSCLC的個(gè)體），并觀察到一致的關(guān)聯(lián)性。

圖5. BRCA2啟動(dòng)子區(qū)域與NSCLC風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性分析，來(lái)源：Cancer Cell

 

結(jié) 語(yǔ)

綜上所述，該研究通過(guò)WGS和SNP基因分型，構(gòu)建完成了迄今為止中國(guó)人群中最大規(guī)模、最全面的胚系變異及其與NSCLC關(guān)聯(lián)的分析結(jié)果。利用高深度的WGS數(shù)據(jù)，研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了高質(zhì)量的單倍型參考面板，并基于WGS和人群特異性的分析策略對(duì)常見(jiàn)和低頻變異進(jìn)行單變異關(guān)聯(lián)分析，確定了5個(gè)新的NSCLC風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)全基因組顯著位點(diǎn)，并進(jìn)一步揭示了5個(gè)高置信度易感基因：SRC、DSP、RGL2、BTN3A2和CCDC116。

此外，通過(guò)完善的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)和功能優(yōu)先排序策略，研究人員在全基因組尺度上系統(tǒng)評(píng)估了NSCLC罕見(jiàn)易感變異的致病性，并證明LOF變體破壞BRCA2或DDR通路顯著增加NSCLC的風(fēng)險(xiǎn)。此外，除了編碼區(qū)域的變異體，研究結(jié)果還提供了非編碼變異體對(duì)疾病的影響，例如BRCA2啟動(dòng)子變異和FAAP100增強(qiáng)子變異，可以對(duì)NSCLC的風(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)生強(qiáng)烈影響。

圖6. 整體研究概圖，來(lái)源：Cancer Cell

基于WGS的研究極大地提高了基于大規(guī)模人群隊(duì)列的遺傳研究效率，而且有助于描繪罕見(jiàn)致病變異的全貌，拓寬領(lǐng)域內(nèi)對(duì)肺癌遺傳病因?qū)W的認(rèn)識(shí)，為肺癌的精準(zhǔn)預(yù)防、治療等提供重要參考。

參考文獻(xiàn)：

Wang et al., Analyses of rare predisposing variants of lung cancer in 6,004 whole genomes in Chinese, Cancer Cell （2022）.DOI:https://doi.org/10.1016/j.ccell.2022.08.013

https://www.cell.com/cancer-cell/fulltext/S1535-6108(22)00377-4