CRISPR-Cas9是目前領(lǐng)域內(nèi)最為常用的基因編輯工具，在基礎(chǔ)科研領(lǐng)域以及臨床應(yīng)用上都有著廣闊的使用前景。然而Cas9在完成靶向位點突變的同時，還會在脫靶位點進行切割，并會造成染色體易位和染色體大片段缺失等染色體結(jié)構(gòu)異常副產(chǎn)物。除此之外，在以腺相關(guān)病毒（Adeno-associated virus，AAV）為遞送載體的體內(nèi)基因編輯治療中，存在著AAV片段高頻插入的現(xiàn)象。這些基因編輯中的副產(chǎn)物嚴重威脅了基因組的穩(wěn)定性，可能會導(dǎo)致細胞的癌化，為基因編輯的治療結(jié)果帶來不確定性。通過抑制Cas9反復(fù)切割靶向位點的完美修復(fù)產(chǎn)物，胡家志課題組近期發(fā)表的Cas9TX可以在CAR-T的改造過程中大幅度降低染色體易位的發(fā)生頻率，但在與臨床應(yīng)用更為密切相關(guān)的體內(nèi)基因編輯場景中，Cas9TX能否有效降低這些副產(chǎn)物的產(chǎn)生仍需要進一步印證。

北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院胡家志研究員課題組與上海中國科學(xué)院神經(jīng)所楊輝研究員課題組在Nature Communications共同發(fā)表題為“Safeguarding genome integrity during gene-editing therapy in a mouse model of age-related macular degeneration”的研究論文。在年齡相關(guān)性黃斑病變（age-related macular degeneration, AMD)的體內(nèi)基因編輯治療模型中，該工作首次定量揭示了CRISPR-Cas9在體內(nèi)基因編輯過程中染色體易位和腺相關(guān)病毒片段插入的發(fā)生模式與發(fā)生頻率，并通過利用該課題組之前開發(fā)的Cas9TX變體大幅度減少了這些副產(chǎn)物在體內(nèi)基因編輯過程中的產(chǎn)生，為CRISPR-Cas9的臨床應(yīng)用提供了重要的指導(dǎo)意義。

年齡性黃斑病變是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致老年人失明的主要原因之一。其中濕性黃斑病變主要是視網(wǎng)膜后的異常血管增生所導(dǎo)致的，目前以注射拮抗調(diào)控血管生成的VEGFA蛋白的小分子或抗體為治療該疾病的主流手段。但反復(fù)注射不但不能保證治療效率，也會對眼部造成局部并發(fā)癥。近期以CRISPR-Cas9為主的基因編輯技術(shù)為治療該疾病帶來曙光，通過激光照射小鼠眼部造成新生血管入侵視網(wǎng)膜來模擬黃斑病變，研究者們進一步通過Cas9靶向Vegfa，從而一勞永逸地消除新生血管的產(chǎn)生，為治療該疾病提供了臨床的可操作性。

利用該課題組開發(fā)的全面評估基因編輯工具安全性的高通量測序方法PEM-seq，該工作首先在以雙AAV載體包裝系統(tǒng)為遞送載體的小鼠眼部脈絡(luò)膜增生編輯模型中（靶向Vegfa位點）發(fā)現(xiàn)了體內(nèi)基因編輯過程中靶向位點和脫靶位點之間、靶向位點和基因組自發(fā)產(chǎn)生的DNA雙鏈斷裂之間仍然會形成染色體易位（頻率接近1%）（下圖a）。與此同時，該研究也發(fā)現(xiàn)靶向位點存在著頻率高至40%的AAV片段整合（下圖b）。更為重要的是，這些副產(chǎn)物在基因編輯后可以在體內(nèi)穩(wěn)定存在12周之久，引發(fā)了研究者對于這些副產(chǎn)物的擔(dān)憂。

該工作利用雙AAV載體遞送Cas9TX靶向小鼠眼部的Vegfa，結(jié)果表明，Cas9TX不僅能夠提高靶向位點的編輯效率，完成對小鼠脈絡(luò)膜增生模型的治療，而且還能大幅度消除靶向位點上所產(chǎn)生的染色體易位（下圖c），值得一提的是，Cas9TX并沒有在脫靶位點造成更高的編輯效率。更為重要的是，該工作發(fā)現(xiàn)Cas9TX也可以有效降低AAV片段在靶向位點的整合（下圖d）。據(jù)悉，這是領(lǐng)域內(nèi)首個可以減少AAV片段在基因編輯過程中插入的基因編輯工具，對臨床應(yīng)用具有重要意義。總體而言，該工作不僅表明Cas9TX可以兼容雙AAV遞送系統(tǒng)用于體內(nèi)基因編輯，大幅低降低基因編輯過程中的副產(chǎn)物，也說明DNA損傷修復(fù)在體外與體內(nèi)的相對保守性，以此為出發(fā)點進行基因編輯安全性優(yōu)化的可行性。

 a. PEM-seq檢測在小鼠眼部Vegfa位點Cas9編輯后染色體易位的發(fā)生頻率；b. PEM-seq檢測在小鼠眼部Vegfa位點Cas9編輯后AAV片段插入的頻率；c. Cas9TX大幅度降低染色體易位產(chǎn)生的比例；d. Cas9TX大幅度降低AAV片段插入的比例

胡家志、楊輝為該論文的共同通訊作者。上海復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院干眼中心主任洪佳旭為本論文提供指導(dǎo)。北京大學(xué)前沿交叉學(xué)院2022屆博士研究生尹健行，上海中科院神經(jīng)所博士后方凱倫、博士后高艷霞為該文章的共同第一作者。北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院本科生元紹鵬，博士研究生歐麗瓊、辛昌昌以及上海輝大公司高級經(jīng)理吳煒煒與吳偉威研究員對此工作亦有重要貢獻。